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2025年3月26日，上海科技大学基因编辑中心的陈佳教授团队在Nature Biotechnology期刊发表标题为“Specific and efficient RNA A-to-I editing through cleavage of an ADAR inhibitor”的研究论文。该研究主要开发了一种名为RtABE（RNA transformer adenosine base editor）的新型RNA编辑系统，通过引入ADAR抑制剂（ADI）来抑制ADAR2脱氨酶的活性，从而实现高效且特异性的RNA A-to-I编辑，并在Hurler综合征小鼠模型中成功纠正了α-l-iduronidase活性缺陷，且未检测到显著的非靶向编辑。

导读

与基因组编辑不同，RNA编辑不会引起基因组DNA的永久性变化，因此可以作为一种有前景的治疗手段。迄今为止，人们已经开发出两种主要策略来诱导靶向的腺苷到肌苷（A-to-I）RNA编辑。在一种策略中，利用工程化的RNA招募内源性RNA腺苷脱氨酶（ADAR），在靶位点介导A-to-I编辑。这种策略已被证明可以在内源性ADAR偏好的序列环境中（例如UAN、CAG、CAA和AAG）诱导高效的编辑。在另一种策略中，通过异位表达工程化的编辑酶（例如将ADAR2脱氨域（ADAR2DD）与RNA结合蛋白融合，如λ噬菌体抗终止蛋白N（λN）、DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（SNAP）的突变体、噬菌体MS2外壳蛋白（MCP）和dCas13），利用引导RNA（gRNA）招募RNA结合蛋白来介导靶向编辑。然而，利用异位表达工程化编辑酶的策略被发现会触发大量的转录组范围的非靶向编辑，从而限制了其广泛应用，特别是在疾病治疗方面。

近期，作者识别了脱氧胞嘧啶脱氨酶抑制剂（dCDI）蛋白结构域，并利用它们消除了DNA碱基编辑器中脱氧胞嘧啶脱氨酶触发的非靶向突变。在本研究中，作者筛选了可能对ADAR2DD具有抑制作用的蛋白结构域，并鉴定出某些腺苷脱氨酶抑制剂（ADIs）。利用ADI，作者开发了一种具有高特异性和高效率的RNA转化腺苷碱基编辑器（RtABE）。

RtABE在扩展的编辑范围内（例如UAN、AAN、CAN和GAN）诱导了高效的A-to-I RNA编辑。在RtABE处理的细胞中，非靶向编辑水平接近背景水平。此外，RtABE被包装到单个腺相关病毒（AAV）中，并在Hurler综合征（黏多糖贮积症I型）模型小鼠的肝脏中诱导了显著的RNA校正。此外，在RtABE处理的小鼠肝脏中未检测到显著的非靶向编辑。因此，RtABE是一种具有广泛编辑范围的特异性和高效RNA编辑系统，可用于基础研究和疾病治疗。

研究结果

1. 鉴定ADI

本研究旨在寻找抑制MCP–ADAR2DD(E488Q)脱靶编辑的腺苷脱氨酶抑制剂（ADI）。作者将mA3CDA2、SIV_Vif和ADAR3等潜在抑制蛋白分别融合到MCP–ADAR2DD(E488Q)的C末端（图1a），并检测其在六个靶点上的编辑效率抑制效果（图1b）。结果显示，mA3CDA2和SIV_Vif显著抑制了编辑效率（图1c），且这种抑制并非由于融合蛋白的降解。

图1. 鉴定ADAR2DD的抑制剂以减少转录组范围的非靶向编辑。

进一步研究发现，人类APOBEC3s（hA3s）的调控结构域也能抑制MCP–ADAR2DD(E488Q)的活性，其中hA3D的调控结构域（hA3DCDA1）效果最为显著（图1f）。全转录组测序表明，hA3DCDA1融合能有效降低全转录组范围的A-to-I脱靶编辑水平（图1g、h）。因此，作者选择hA3DCDA1作为ADI，并命名为A3DADI，用于后续研究。

图1. 鉴定ADAR2DD的抑制剂以减少转录组范围的非靶向编辑。

2. 非靶向编辑分析

作者发现，MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA编辑系统引发了广泛的非靶向编辑。于是作者将ADAR2DD(E488Q)单独转染到293FT细胞中，结果显示其引发的转录组范围的A到I编辑水平略高于未转染对照组（图2b）。然而，当MCP与ADAR2DD(E488Q)结合时，即使没有相应的agRNA，也会引发更高水平的非靶向编辑（图2b）。此外，将MCP融合到ADAR2DD(E488Q)的C末端同样引发了高水平的转录组范围的A到I编辑（图2b）。这些结果表明，MCP与非靶向RNA的随机结合可能是MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA编辑系统在某些非靶向位点引发非靶向编辑的原因。

图2. 非靶向编辑在ADAR2DD结合位点和MCP结合位点被诱导发生。

为了寻找避免非靶向编辑的方法，作者尝试将不同的RNA结合蛋白融合到ADAR2DD上。结果发现，某些RNA结合蛋白（如dRanCas13b）融合后靶向编辑效率较低，而另一些（如λN）融合后虽然靶向编辑效率较高，但非靶向编辑水平也较高，且无法通过A3DADI融合有效抑制。相比之下，MCP可能是一个合适的RNA结合域，因为将MCP融合到ADAR2DD上可以诱导高水平的靶向编辑（图1b），并且其非靶向编辑可以被A3DADI有效抑制（图1g，h）。

进一步分析发现，MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA编辑系统引发的高水平转录组范围的非靶向编辑也可以部分归因于其改善的蛋白稳定性。WB结果显示，MCP–ADAR2DD(E488Q)的蛋白表达水平高于单独的ADAR2DD(E488Q)。非靶向编辑位点可以分为ADAR2DD依赖和MCP依赖两类。分析显示，一些位点在仅用ADAR2DD(E488Q)处理的样本中被编辑，被称为ADAR2DD依赖的非靶向位点（图2c）；而另一些位点仅在MCP–ADAR2DD(E488Q)处理的样本中被编辑，被称为MCP依赖的非靶向位点（图2c）。

图2. 非靶向编辑在ADAR2DD结合位点和MCP结合位点被诱导发生。

深度测序结果显示，ADAR2DD(E488Q)和含有MCP的融合蛋白（如MCP–ADAR2DD(E488Q)和ADAR2DD(E488Q)–MCP）在ADAR2DD依赖和MCP依赖的非靶向位点上均引发了不同程度的编辑（图2d）。这些结果表明，ADAR2DD依赖的非靶向位点的非靶向编辑可以由各种含有ADAR2DD(E488Q)的蛋白引发（图2e），并且将MCP融合到ADAR2DD(E488Q)上也会导致在MCP依赖的非靶向位点处的非靶向编辑（图2e），此外还提高了蛋白稳定性。

3. RtABE的开发与优化

作者旨在开发一种高效的RNA碱基编辑器（RtABE），通过引入分裂的烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEVp）来减少非靶向RNA编辑，同时保持靶向编辑效率。研究发现，在MCP–ADAR2DD(E488Q)和A3DADI之间插入TEVp切割位点（TS），并通过共表达λN–TEVc–2A–TEVn版本的分裂TEVp，可以有效降低非靶向编辑水平（图3a、c、d）。

图3. 工程化改造TEVp和agRNA以减少非靶向编辑并提高靶向编辑效率。

然而，这种分裂TEVp的共表达导致靶向编辑效率下降（图3b）。为了提高靶向位点的切割效率，作者进一步设计了增强型agRNA（eagRNA），通过添加BoxB aptamers招募λN融合的分裂TEVp。其中，eagRNA_V5版本在靶向位点表现出最高的编辑效率，同时保持低水平的非靶向编辑（图3e、f、g、h、i）。

图3. 工程化改造TEVp和agRNA以减少非靶向编辑并提高靶向编辑效率。

在此基础上，作者开发了初级版本的RtABE，通过共表达MCP–ADAR2DD(E488Q)–TS–A3DADI、eagRNA_V5和λN–TEVc–2A–TEVn实现（图4a）。尽管该版本在两种类型的非靶向位点诱导了低水平的非靶向编辑，但仍有改进空间。

为进一步提高编辑特异性，作者根据ADAR2DD与双链RNA底物相互作用的结构信息，在ADAR2DD的关键位置引入氨基酸替换。经过筛选，发现含有K475Q/E488Q或K475I/S486A突变的RtABE版本在靶向与非靶向编辑比率上表现最佳（图4b、c、d、e、f）。最终，这两种优化后的RtABE版本分别被命名为RtABE_V1和RtABE_V2（图5a），它们在保持高效靶向编辑的同时，显著降低了非靶向编辑水平，为RNA编辑技术的发展提供了新的思路和工具。

图4. 基于结构的ADAR2DD工程化改造以最小化非靶向编辑。

4. RtABE的特性分析与其他编辑器的对比

作者使用RtABE_V1和RtABE_V2（图5a）在18个靶向位点诱导A到I编辑，包括11个UAN序列背景（ADARs偏好靶向位点）和10个VAN序列背景的靶向位点（图5b）。结果显示，RtABEs在所有靶向位点均诱导了明显的A到I编辑，且RtABE_V1的编辑效率通常高于RtABE_V2（图5b）。

全转录组测序表明，两种版本的RtABEs保持了低水平的转录组范围非靶向编辑，RtABE_V2的非靶向编辑水平更低（图5c）。此外，RtABEs的非靶向编辑位点数量显著减少，RtABE_V2进一步将非靶向编辑位点减少到约50个（主要集中在CDS和UTR区域）。这些非靶向位点未能与eagRNA的反义区域形成稳定双链，表明其非靶向编辑不太依赖于序列特异性。

图5. 将RtABE与其他RNA碱基编辑系统进行比较。

作者还分析了RtABEs在不同细胞系中的表现。在HeLa和U2OS细胞中，RtABE_V1和RtABE_V2在四个靶向位点表现出高效的编辑能力（图5f），且未显著改变转录组范围的基因表达水平。此外，RtABEs在招募内源性ADARs的RNA编辑系统中表现出色，特别是在293FT细胞中，RtABEs（尤其是RtABE_V2）的非靶向编辑水平接近天然RNA A到I编辑水平（图5e）。相比之下，异位表达工程化ADARs的编辑器通常会引发更高水平的非靶向编辑。

图5. 将RtABE与其他RNA碱基编辑系统进行比较。

为了进一步优化编辑效率，作者设计了不同AS区域长度的eagRNAs，并发现当靶向A位于AS区域中间时，编辑效率最高。此外，通过删除与旁观者腺苷相对的碱基，可以将旁观者编辑降低到背景水平。在与其他RNA编辑系统（如dRanCas13b–ADAR2DD(E488Q)、cadRNA和CLUSTER）的对比中，RtABE_V1和RtABE_V2在多种细胞系中均表现出更高的编辑效率（图5f），即使在ADAR1缺失的细胞系中，RtABEs仍能高效诱导A到I编辑。这些结果表明，RtABEs在保持高效靶向编辑的同时，显著降低了非靶向编辑水平，具有广泛的适用性和优越的编辑特性。

5. RtABE的体内编辑实验

作者将RtABE应用于体内RNA编辑，以治疗Hurler综合征为研究背景。他们设计了一种针对小鼠Idua基因中W392X突变的eagRNA，该突变导致α-L-艾杜糖苷酶（IDUA）缺乏，模拟人类Hurler综合征。

为了测试RtABE在RNA水平上纠正该突变的效率，作者首先在小鼠细胞模型（IDUA–W392X）中验证了RtABE_V1和RtABE_V2的编辑能力，发现两者均能有效介导编辑，并恢复IDUA活性（图6a）。

随后，作者将RtABE_V2与eagRNA包装到AAV8载体中（图6a），并与针对相同突变的MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA编辑系统进行对比。两种AAV载体以两种滴度（1×10¹²和3×10¹² vg）通过尾静脉注射到Hurler综合征模型小鼠体内。结果显示，接受高滴度MCP–ADAR2DD(E488Q) AAV注射的小鼠在注射后3至4周内死亡，而接受RtABE_V2或其他处理的小鼠均存活（图6b）。

图6. RtABE在Hurler综合征小鼠的肝脏中诱导了高效且特异性的RNA纠正。

在肝脏样本中，接受低滴度MCP–ADAR2DD(E488Q) AAV或任何滴度RtABE_V2 AAV处理的小鼠均检测到了靶向W392X突变位点的A到I编辑（图6c）。其中，接受高滴度RtABE_V2 AAV注射的小鼠肝脏中，注射后4周平均RNA纠正率为27%（范围11%至45%），注射后8周平均RNA纠正率为18%（范围18%至19%）（图6c）。相比之下，MCP–ADAR2DD(E488Q)即使在低滴度下也引发了显著的转录组范围非靶向编辑，而RtABE_V2在任何滴度或时间点后均未引发显著的非靶向编辑（图6f、g）。

此外，RtABE_V2未引发可检测的旁观者编辑，也未显著改变mIdua转录本的表达（图6d、e）。在治疗效果方面，RtABE_V2介导的RNA编辑显著恢复了IDUA活性，并降低了糖胺聚糖（GAG）浓度（图6h、i），显示出良好的治疗潜力。

图6. RtABE在Hurler综合征小鼠的肝脏中诱导了高效且特异性的RNA纠正。

展望

RNA编辑能够诱导转录本的瞬时变化，是一种极具潜力的疾病治疗策略。然而，目前通过异位表达工程化ADARs的RNA编辑工具往往会引发非靶向编辑。本研究开发了一种新的RNA碱基编辑系统RtABE，能够实现特异且高效的A到I编辑，并扩展了编辑范围。

在RtABE系统中，效应模块（ADAR2DD）在结合靶位点之前保持失活状态，因为它与抑制剂（A3DADI）融合。eagRNA的AS区域可以结合靶转录本，而eagRNA中的MS2和BoxB aptamers可以分别招募失活的ADAR2DD和TEVc。eagRNA招募的TEVc与自由扩散的TEVn相互作用，重新构成完整的TEVp，并随后切割A3DADI以在靶位点激活ADAR2DD，实现高效的A到I编辑。为了验证这一模型，作者将RtABE系统与无eagRNA或eGFP靶向eagRNA共转染，发现缺乏eagRNA或存在eGFP靶向eagRNA时，A3DADI并未被本质切割。此外，通过siRNA敲低内源性靶转录本（CTNNB1）后，A3DADI未被显著切割，而当内源性靶转录本正常表达时，A3DADI被明显切割。因此，RtABE通常在结合靶RNA转录本之前保持失活状态，并在靶位点转变为活性状态，类似于作者近期的DNA碱基编辑研究。

与通过异位表达工程化ADARs的已发表RNA编辑系统相比，后者会引发显著的非靶向编辑，RtABE_V2处理的人细胞中未检测到明显的非靶向编辑事件。值得注意的是，两只注射高滴度表达MCP–ADAR2DD(E488Q) RNA编辑系统的AAV的小鼠在注射后3至4周死亡，其原因尚待进一步研究。与细胞系中的结果一致，即使在低滴度下，注射表达MCP–ADAR2DD(E488Q)的AAV的小鼠肝脏中也检测到高水平的转录组范围非靶向编辑。相比之下，RtABE_V2在小鼠肝脏中未引发显著的非靶向编辑。因此，与使用异位表达工程化ADARs的已发表RNA编辑系统相比，RtABE具有更好的安全性。

与通过招募内源性ADARs的RNA编辑策略相比，RtABE在以前难以编辑的位点（例如GAN）诱导了明显的A到I编辑效率。此外，eagRNA的设计相对简单。作者建议构建几个AS区域长度为20至30个核苷酸且靶向A位于AS区域中间的eagRNA。在疾病治疗背景下，RtABE在纠正W392X突变方面表现出平均27%（范围11%至45%）的编辑频率（注射后4周）和平均18%（范围18%至19%）的编辑频率（注射后8周）。值得注意的是，过早的W392X终止密码子可能触发mIdua mRNA的无义介导衰变（NMD），因此，恢复这一过早终止密码子的A到I编辑可以避免NMD效应，最终可能增加绝对A到I编辑产量。最近，LEAPER 2.0被报道通过AAV递送在非人灵长类动物肝脏和小鼠中枢神经系统中诱导约30%至50%的A到I编辑效率。此外，除了遗传编码的gRNA外，化学修饰的寡核苷酸也被用于招募内源性ADARs，在非人灵长类动物肝脏中诱导高达50%的高效编辑，并显示出有希望的临床结果。RtABE是否能在非人灵长类动物中诱导高效RNA编辑尚待进一步研究。

尽管具有上述优点，但RtABE仍存在需要克服的局限性。首先，RtABE整个系统比已发表的RNA碱基编辑器更复杂、更大，因此RtABE必须使用迷你CMV启动子才能包装到单个AAV中。因此，将包含组织特异性启动子（通常比迷你CMV启动子更大）的RtABE系统包装到AAV中是一个挑战。其次，RtABE系统仍包含一些非人类成分（例如分裂的TEVp和MCP），这些成分可能在RNA编辑需要长期表达的情况下引发免疫原性。此外，RtABE的当前版本在某些靶位点的编辑效率相对低于通过异位表达工程化ADARs的RNA编辑系统。此外，本研究中用于所有RNA编辑系统的gRNA表达质粒（包括RtABE系统、通过招募内源性ADARs的系统和通过异位表达工程化ADARs的系统）包含一个嘌呤霉素抗性基因，并通过嘌呤霉素选择最大化细胞转染效率，然后提取RNA进行编辑分析，这可以增加细胞实验中的编辑水平。通过化学修饰eagRNA以增强其稳定性，可能会进一步提高RtABE的编辑效率。

有趣的是，作者还尝试将A3DADI融合到RNA胞嘧啶碱基编辑器（RESCUE）上，发现A3DADI也可以抑制RESCUE的编辑效率。因此，类似于RtABE的策略或许也可用于降低C到U RNA碱基编辑器的非靶向效应，值得进一步研究。

总之，RtABE是一种具有广泛适用范围的特异且高效的RNA编辑系统。RtABE可用于纠正致病性G到A突变或恢复因过早终止密码子而中断的蛋白质翻译，在基础研究以及未来的临床疾病治疗中具有潜在应用价值。

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